粗蛋白的測定

參考標準：JJG 196-2006 常用玻璃量器檢定規程

GB-T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法

實(shí)驗原理：凱氏定氮法是使樣品經(jīng)硫酸和催化劑一同加熱消化，使有機氮分解轉化為氨與硫酸化合為硫酸氫銨。然后加堿蒸餾，使銨游離出來(lái)，用硼酸吸收，再用標準鹽酸滴定，計算氮的含量，乘以6.25可折算成粗蛋白含量。

主要儀器及試劑：

1.凱氏定氮瓶及蒸餾裝置  

2.五水硫酸銅  

3.硫酸鉀     

4.98%濃硫酸

5.2%硼酸溶液:2g硼酸溶于100ml水溶液

6.40%氫氧化鈉溶液:40g氫氧化鈉溶于100ml水溶液

7.0.1%甲基紅：0.1g甲基紅溶于100ml乙醇溶液，攪拌溶解                     

8.0.5%溴甲酚綠：0.5g溴甲酚綠溶于100ml乙醇溶液，攪拌溶解

9.甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑：0.1%甲基紅與0.5%溴甲酚綠等體積混合，保存期三個(gè)月。

10.0.02mol/L的鹽酸標準溶液(保存期2個(gè)月)

實(shí)驗操作步驟：

1.稱(chēng)樣：

按粗蛋白含量稱(chēng)取樣品質(zhì)量（可控制點(diǎn)：降低容量誤差對結果絕對誤差的影響），

準確至0.0002g，置于干燥的消化管中（可控制點(diǎn)：避免樣品粘掛于消化管壁影響樣品的消化）。

2.消化：加入硫酸銅約0.4g，加入硫酸鉀約6g，輕輕抖動(dòng)搖勻，再加入15ml濃硫酸，搖勻，開(kāi)始應小火加熱使樣品焦化、泡沫消失(可控制點(diǎn)：避免樣品在消化過(guò)程中上沖粘附于消化管壁)，在消化爐上消化一定的時(shí)間至消化液呈澄清透明的藍綠色，相應的消化時(shí)間對應于上表中，最終的消化仲裁判定應在溶液澄清后繼續消化至少30min（可控制點(diǎn)：消化完全）。

3.轉移：將試樣消煮液冷卻，用洗瓶加入少量蒸餾水稀釋?zhuān)ú豢芍苯愚D移高濃度的消煮液，因為稀釋是個(gè)劇烈的放熱過(guò)程，容易炸裂容量瓶），搖勻，轉入100ml容量瓶中，轉移過(guò)程應充分，A.確保轉移過(guò)程中消化管口始終在漏斗之上并向下傾斜，用帶細尖嘴洗瓶沖洗管口3遍，在漏斗上靠掉管口邊緣溶液再向上豎起，B.沖洗內壁，上下甩動(dòng)3次，同A轉移入容量瓶中，再重復2次。

4.定容:冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣分解液。嚴禁熱定容，即溶液未冷卻進(jìn)行定容。要加速冷卻過(guò)程，可將容量瓶蓋好蓋子放入流水中進(jìn)行冷卻。

5.蒸餾：

A.蒸汽發(fā)生器的水中應加入甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，在蒸餾過(guò)程中保持此液為橙紅色，否則需補加硫酸（可控制點(diǎn)：確保水中氨以硫酸銨形式存在，保證蒸餾過(guò)程中空白的穩定性）。

B.將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20ml硼酸吸收液和2滴溴甲酚綠—甲基紅指示劑的錐形瓶?jì)取?span>

C.用待蒸餾試樣分解液潤洗移液管2cm長(cháng)末端，再放入容量瓶中吸取試液潤洗移液管2-3次；準確移取試樣分解液10.00ml注入蒸餾裝置的反應室中，放入時(shí)移液管應靠在反應室入口的底部上，放完后不可用蒸餾水沖洗移液管外壁；用少量蒸餾水沖洗進(jìn)樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml左右氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，直至反應液變棕色，將玻璃塞塞好，且有堿剩余在入口處密封，防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶使冷凝管末端離開(kāi)吸收液面，用蒸餾水沖洗冷凝感末端，洗液均流入錐形瓶?jì)龋僬麴s1min（可控制點(diǎn)：以pH試紙指示蒸餾終點(diǎn)），然后停止蒸餾。

6.滴定：用0.02mol/L標準鹽酸溶液滴定，溶液由綠色或藍綠色變?yōu)榈t色為終點(diǎn)。同樣條件做空白，取10.00ml水從步驟2開(kāi)始或者從步驟5開(kāi)始。

7.計算：

粗蛋白（%）= EQ EQ EQ \A() \F(（V₁-V₀）×C×0.0140×6.25,m×10.00/100.0) ×100%

注意事項：

1.消化時(shí)若不易呈透明溶液，可將試液放冷后慢慢加入30％過(guò)氧化氫2—3mL，以促進(jìn)氧化。如試樣是含脂類(lèi)特別多的樣品，有時(shí)需要增加濃硫酸的用量，如分解冷卻后，消化液呈完全固體狀態(tài)，則是濃硫酸量不足，氮的回收率會(huì )降低。

2.消化過(guò)程中保持緩慢沸騰，避免試樣濺于瓶壁，難于消化使氨損失。

3.實(shí)驗中要保證硫酸足量，因為過(guò)多的硫酸鉀形成硫酸氫鉀，會(huì )削弱了硫酸的消化作用，硫酸鉀的作用是增加溶液的沸點(diǎn)，硫酸鉀添加量過(guò)少加速消化作用將減弱，加入過(guò)多溶液會(huì )析出結晶，共結晶現象將使部分硫酸氫銨損失。

4.消化時(shí)間視不同樣品含脂肪，蛋白質(zhì)的量而定，消化液按黑色→黃綠色→綠色→藍色或淺綠色變化，一般樣品消化液呈現綠色后，再消化30min即可（樣品消化液通常開(kāi)始為黑色，不久變成藍色澄清狀態(tài)，這種過(guò)程是炭化的有機物完全被氧化的變化，而它決不表示樣品中的氮素全部轉化為NH⁴⁺的變化，一般情況樣液澄清后繼續消化60min，其氮素的回收率最理想。

5.通入蒸汽蒸餾時(shí)，吸收瓶中的硼酸接收液溫度不宜超過(guò)40℃，如果超過(guò)45℃硼酸對NH₃的吸收減弱，造成氮的損失。可以采取的措施包括降低蒸汽通入量(比如分流蒸汽或者降低加熱溫度)、增加冷卻水流量、使用其他可能的措施降低吸收液溫度。

6.NH⁴⁺是以NH₃的形式完全蒸餾出來(lái)的，可用pH試紙或紅色石蕊試紙檢驗餾出液是否呈堿性以判定蒸餾終點(diǎn)。

7.標準酸濃度的準確濃度（程度）對測定結果影響很大，因此，標準酸的濃度必須準確認真標定。

8. 硫酸銨回收率測定

精確稱(chēng)取0.25g～0.30g硫酸銨，代替試樣按標準中試樣消解方法進(jìn)行消解，測得的硫酸銨中氮的含量應是21.19±0.2%,否則應檢查儀器的氣密性、標準溶液是否正確。

氮含量（%）= EQ EQ

式中：

V₁   ——滴定試樣所需標準溶液的體積， V₀  ——滴定空白所需標準溶液的體積，

C  ——標準溶液的濃度，             M  ——試樣的質(zhì)量，

100——試樣分解液定容體積，         10 ——用于蒸餾的分解液的體積。

硫酸銨有吸濕性，固結成塊，在105℃烘干1個(gè)小時(shí)能保證硫酸銨的干燥同時(shí)把硫酸銨分解質(zhì)量損失降低在可接受的誤差范圍內<0.2%。